沙門氏菌流行性的增加以及豬對抗生素耐藥性增加促使人們尋找抗生素的替代品。腸桿菌肽(MccJ25)是一種由大腸桿菌產(chǎn)生的抗菌肽，對包括腸道沙門氏菌在內(nèi)的幾種病原菌都有很強(qiáng)的抑制作用。
本研究旨在體外評價腸桿菌肽對豬結(jié)腸微生物區(qū)系組成和代謝活性的影響。以天然存在于人和動物的胃腸道中的羅伊氏乳桿菌與抗生素利福平進(jìn)行對比試驗。使用Illumina MiSeq技術(shù)對16S rRNA進(jìn)行測序以評估微生物多樣性，并使用液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)和多元分析來評估抗生素降解產(chǎn)物和監(jiān)測豬結(jié)腸微生物區(qū)系代謝組的變化。
結(jié)果表明，腸桿菌肽和羅伊氏乳桿菌處理只引起豬結(jié)腸微生物區(qū)系微生物多樣性和代謝組的細(xì)微變化，而利福平引起氨基酸水平的顯著改變。盡管這些發(fā)現(xiàn)需要在體內(nèi)進(jìn)行驗證，但考慮到腸桿菌肽對病原體的選擇性和強(qiáng)大的抑制活性，這項研究為考慮腸桿菌肽作為獸醫(yī)和農(nóng)業(yè)應(yīng)用中抗生素的可能替代品提供了第一個概念證明。
腸桿菌肽對豬腸道菌群連續(xù)培養(yǎng)模型的影響
Impact of microcin J25 on the porcine microbiome in a continuous culture model
由于國際市場的不斷擴(kuò)大，生豬生產(chǎn)已成為增長最快的產(chǎn)業(yè)之一。2019年，豬肉是全球第二大消費(fèi)肉類，占肉類總產(chǎn)量的32.6%。盡管如此，養(yǎng)豬業(yè)近年來遭受了重大損失，主要原因是細(xì)菌感染率不斷上升。沙門氏菌會引起急性疾病，導(dǎo)致死亡率增加和生產(chǎn)力下降。豬是腸道沙門氏菌的主要宿主，沙門氏菌感染與豬只的腹瀉密切相關(guān)。許多沙門氏菌血清型已被證明與豬的慢性潰瘍性結(jié)腸炎或壞死性小腸結(jié)腸炎有關(guān)。因此，在養(yǎng)豬場，特別是在工業(yè)化國家，控制沙門氏菌感染在很大程度上是通過使用抗生素實現(xiàn)的。
抗生素被廣泛應(yīng)用于人類和獸醫(yī)以及家畜生產(chǎn)中，以治療細(xì)菌性疾病和促進(jìn)動物生長。它們在養(yǎng)豬生產(chǎn)中用作生長促進(jìn)劑是常見的，并對提高牲畜生產(chǎn)力和降低生產(chǎn)成本做出了重大貢獻(xiàn)。然而，它們的過度使用導(dǎo)致了多種抗藥性細(xì)菌的出現(xiàn)。這引起了公眾的關(guān)注，并導(dǎo)致幾個國家禁止在動物飼料中使用抗生素作為生長促進(jìn)劑?，F(xiàn)在迫切需要有效替代常規(guī)抗生素，以維持豬群健康和生產(chǎn)力。到目前為止提出的最有希望的替代品是由細(xì)菌產(chǎn)生的天然抗菌肽。
抗菌肽是由細(xì)菌產(chǎn)生的，其分子質(zhì)量通常小于10 kDa。與常用的廣譜抗生素不同，抗菌肽是從mRNA翻譯而來的，其活性譜很窄，在納摩爾濃度下抑制相同或密切相關(guān)物種的菌株?？咕目蓮V泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)食品、人類和獸醫(yī)等領(lǐng)域。腸桿菌肽(MccJ25)是研究最多的抑制革蘭氏陰性菌的抗菌肽之一。它具有典型的套索結(jié)構(gòu)，這種高度緊湊的結(jié)構(gòu)使腸桿菌肽對變性條件、高溫、極端酸堿性和某些蛋白酶具有顯著的穩(wěn)定性。添加腸桿菌肽的日糧已被證明可以改善斷奶仔豬的生長性能，減輕腹瀉和全身炎癥。伴隨著大腸桿菌減少，乳桿菌和雙歧桿菌種類的增加，提高了短鏈脂肪酸(SCFA)的含量。
在本研究中，我們使用PolyFermS連續(xù)發(fā)酵模型模擬豬近端結(jié)腸，在體外評價腸桿菌肽對豬結(jié)腸微生物區(qū)系組成和代謝活性的影響。將腸桿菌肽與廣譜常規(guī)抗生素利福平、羅伊氏乳桿菌進(jìn)行了比較。此外，我們通過研究這三種抗菌化合物的降解產(chǎn)物，探究它們對豬結(jié)腸微生物區(qū)系代謝的影響。
采用PolyFermS體外連續(xù)發(fā)酵模型，采用改良的Macfarlane培養(yǎng)基模擬豬近端結(jié)腸。在35天的發(fā)酵過程中，含有固定化豬糞便微生物群的第一階段反應(yīng)器與兩個第二階段控制和測試反應(yīng)器并行運(yùn)行，測試腸桿菌肽對微生物群組成和代謝活性的影響。以天然存在于人和動物的胃腸道中的羅伊氏乳桿菌與抗生素利福平進(jìn)行對比試驗。使用Illumina MiSeq技術(shù)對16S rRNA進(jìn)行測序以評估微生物多樣性，并使用液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)和多元分析來評估細(xì)菌素/抗生素降解產(chǎn)物和監(jiān)測豬結(jié)腸微生物區(qū)系代謝組的變化。
圖1：連續(xù)發(fā)酵實驗的實驗裝置。
(A)由一個接種反應(yīng)堆和兩個試驗反應(yīng)堆組成的PolyFermS模型概述。IR：固定化豬糞細(xì)菌的接種反應(yīng)器(30%v/v)；TR1、TR2：試驗生物反應(yīng)器；S：穩(wěn)定期；T：處理期；W：洗滌期。
(B)實驗處理和樣本收集時間表。
根據(jù)PMA-qPCR分析，在加入沙門氏菌和抗菌藥物后的前12小時內(nèi)，試驗反應(yīng)器中特定菌群數(shù)量在總體組成上保持相對穩(wěn)定。然而，利福平對總細(xì)胞和擬桿菌的數(shù)量有誘導(dǎo)作用，直到發(fā)酵結(jié)束，除了乳酸菌科外，這些細(xì)菌群重新生長。在發(fā)酵12小時后，單獨(dú)用沙門氏菌處理也觀察到類似的效果，特別是對乳酸菌數(shù)量的影響。相比之下，羅伊氏乳桿菌和腸桿菌肽對細(xì)菌總數(shù)沒有顯著影響。
通過對16S rRNA基因的測序，評估了受試抗菌劑對微生物區(qū)系組成的影響。沙門氏菌處理和羅伊氏乳桿菌處理組沒有檢測到微生物組成的顯著變化，這表明這些處理對24小時發(fā)酵過程中測得的總體微生物區(qū)系組成沒有影響。另一方面，與沙門氏菌相比，腸桿菌肽和利福平有顯著差異(p＝0.001)。
利用香農(nóng)指數(shù)和asv聚類，通過α多樣性研究了處理對豬腸道微生物區(qū)系的影響(圖2)。結(jié)果表明，在發(fā)酵結(jié)束前的8h，利福平處理后的α多樣性顯著降低，證實了利福平對微生物區(qū)系組成具有影響。在結(jié)腸發(fā)酵結(jié)束時，沙門氏菌組α多樣性下降，但并不顯著；腸桿菌肽和羅伊氏乳桿菌處理組在發(fā)酵過程中沒有引起阿爾法多樣性的顯著變化。
圖2：用16S rRNA基因擴(kuò)增序列測序法測定沙門氏菌單獨(dú)接種(Salmo)及其與腸桿菌肽（MccJ25）、羅伊氏乳桿菌(Reut)或利福平(Rifa)合用對豬腸微生物區(qū)系的影響。
通過門水平的分類分析，進(jìn)一步評估了受試抗菌劑對豬腸道微生物區(qū)系組成的影響。結(jié)果表明，利福平處理導(dǎo)致了變形桿菌和菌門變形桿菌的相對豐度增加(圖3)。
圖3：沙門氏菌單獨(dú)接種(Salmo)及其與腸桿菌肽（MccJ25）、羅伊氏乳桿菌(Reut)或利福平(Rifa)聯(lián)合接種后，豬微生物區(qū)系基于16S rRNA基因的微生物群落結(jié)構(gòu)。
此外，從8小時開始，利福平對大腸桿菌(ASV002)的相對豐度顯著增加(12小時的相對豐度超過44%)(圖4)。
圖4：沙門氏菌單獨(dú)接種(Salmo)及其與腸桿菌肽（MccJ25）、羅伊氏乳桿菌(Reut)或利福平(Rifa)聯(lián)合接種對豬腸微生物區(qū)系的影響。
這些數(shù)據(jù)表明，與其他測試的抗菌劑相比，利福平顯著影響微生物區(qū)系組成，會影響腸道微生物區(qū)系的代謝活動。
用LC-MS分析發(fā)酵液顆粒提取物，以評價腸桿菌肽、羅伊氏乳桿菌和利福平對豬結(jié)腸微生物區(qū)系代謝的影響。如圖5所示，腸桿菌肽和利福平對代謝組學(xué)的影響最大，但腸桿菌肽的作用隨著時間的推移而降低，而利福平的作用則增加(圖5B)。處理24 h后，腸桿菌肽處理組的代謝組學(xué)特征與試驗前接近。相比之下，利福平對豬結(jié)腸微生物區(qū)系代謝組有顯著影響，且隨時間延長而增加。
圖5：PolyFermS模型中豬結(jié)腸微生物區(qū)系的代謝組譜。
(A)通過LC-MS獲得的每個處理的基峰色譜圖。
(B)從LC-MS數(shù)據(jù)獲得的PCA計分圖(左：PC1與PC2，右：PC1與PC3)。
由于腸桿菌肽對病原菌的選擇性、強(qiáng)大的抑制活性、穩(wěn)定性以及它引起的微生物區(qū)系組成的細(xì)微變化，腸桿菌肽可能被認(rèn)為是養(yǎng)豬領(lǐng)域中可能的抗生素替代品。
參考文獻(xiàn)：Naimi S, Zirah S, Greppi A, Lacroix C, Rebuffat S, Fliss I. Impact of microcin J25 on the porcine microbiome in a continuous culture model. Front Microbiol.
微信公眾號
