由于近年來抗生素濫用帶來了巨大的環(huán)境壓力，ARGs（抗生素耐藥基因）被歸類為新興的污染物。ARGs廣泛存在水、土壤、沉積物、氣溶膠、作物和微塑料等環(huán)境中。ARGs的富集和多重耐藥菌的出現(xiàn)可能會導(dǎo)致抗生素作用降低，從而增加疾病的治療成本和難度。因此，ARGs越來越受到專家和公眾的關(guān)注。
抗菌肽在殺滅和控制微生物以及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中扮演著重要的角色，因此被用作水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素的備選方案。當(dāng)前在水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗菌肽的研究主要集中在它們功能上的報道，抗菌肽能夠使蝦具有更加高效的免疫反應(yīng)，提高吞噬細(xì)胞對鱒魚養(yǎng)殖中活微生物的吞噬能力和細(xì)胞內(nèi)殺傷能力，并且表現(xiàn)出廣譜的抵御各種微生物的活性。本研究通過魚的養(yǎng)殖試驗來探索使用枯草三十七肽干預(yù)抗生素耐藥的潛在功能。對ARGs在不同環(huán)境中的分布以及不同處理的微生物群落進(jìn)行分析研究。為枯草三十七肽應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖替代抗生素控制ARGs提供有價值的理論依據(jù)。
本試驗使用的水產(chǎn)抗生素包括磺胺嘧啶（SDZ，含量≥98%）、土霉素（OTC，1mg藥物效價≥930IU）和恩諾沙星（EFC，含量≥98%）。本試驗使用含量為99%的枯草三十七肽購自中農(nóng)穎泰生物肽公司（中國北京）。本水產(chǎn)養(yǎng)殖試驗選用的魚為尼羅羅非魚，購自林春漁業(yè)公司（中國廣州），在自來水水箱中培育3個月并收集樣品進(jìn)行下一步的分析。
試驗分為1個對照組和4個試驗組。對照組飼料中不含任何抗生素和抗菌肽，各試驗組分別添加枯草三十七肽（Cecropin peptide，CP）、SDZ、OTC、EFC（按200mg/kg的含量分別添加到飼料中）。3個月后收集試驗各組的水樣分別命名為WFF\WCP\WSDZ\WOTC\WEFC，從一個沒有羅非魚的對照水箱中收集水樣并標(biāo)記為WCK基礎(chǔ)水樣；收集的殘留物樣品（主要由魚排泄物組成）分別命名為RFF\RCP\RSDZ\ROTC\REFC；肌肉樣品分別標(biāo)記為FFF\FCP\FSDZ\FOTC\FEFC。
ARGs在羅非魚養(yǎng)殖系統(tǒng)不同環(huán)境中的分布
枯草三十七肽有助于減少耐藥菌的豐度；經(jīng)過枯草三十七肽的處理ARGs在魚肌肉中遷移的風(fēng)險相對較低；枯草三十七肽處理的樣品中低豐度的intI1可以有效降低ARGs和多重耐藥菌的傳播風(fēng)險。
圖1 羅非魚養(yǎng)殖系統(tǒng)水、殘留物和魚肌肉樣品中目標(biāo)ARGs的絕對豐度熱圖。白色空白表示未檢測到。
在魚的飼料中添加枯草三十七肽可以有效地減少ARGs在魚肌肉和殘留物（主要是糞便）中的積累。而且，在FCP/RCP中所有目標(biāo)ARGs的總絕對豐度與FFF/RFF相比是比較低的，也證明了枯草三十七肽能有效地減少ARGs的積累。
圖2 不同樣品中不同類型目標(biāo)ARGs的總絕對豐度（a）以及所有目標(biāo)ARGs、16S rRNA和intI1的總絕對豐度（b）。
羅非魚養(yǎng)殖中不同環(huán)境的微生物群落特征
不同抗生素處理樣品的OTU數(shù)據(jù)顯著的高于枯草三十七肽處理組和對照組。枯草三十七肽處理組和對照組之間重疊的OTU占枯草三十七肽處理的水/殘留物/魚肌肉樣品中總OTU的70%/55.4%/62.5%，說明對照組與枯草三十七肽處理組的微生物群落具有比較相似的結(jié)構(gòu)。不同抗生素處理樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)也存在一定差異，說明不同的抗生素可能對微生物群群落具有不同的影響。
圖3 不同樣品主要門類組成（a）、不同處理微生物群落三元圖（b）、不同處理樣品Circos圖（c）、不同樣品基于微生物群落的PLS-DA圖 （d）。
不同處理下16 S rRNA、intI1、ARGs和菌群的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)
對照組、枯草三十七肽處理組和抗生素處理組樣品的ARG-ARG、屬-屬、和ARG-屬的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)之間存在著顯著性關(guān)聯(lián)，分別達(dá)到了352、250和746。枯草三十七肽的處理有效地降低了ARG-ARG、ARG-屬和屬-屬之間的相關(guān)性。
經(jīng)過枯草三十七肽處理后樣品中的多重耐藥菌顯著減少到3個屬，多重耐藥菌的減少有利于降低ARGs帶來的潛在風(fēng)險，說明添加枯草三十七肽可能具有控制水產(chǎn)養(yǎng)殖中的ARGs和多重耐藥菌產(chǎn)生的作用。
使用抗生素養(yǎng)殖羅非魚可能會增加ARGs（抗生素耐藥基因）和相應(yīng)的多重耐藥菌的風(fēng)險。
圖4 不同樣品中intI1、16 S rRNA、靶ARG和屬之間的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)，對照（a）、枯草三十七肽處理（b）和抗生素處理（c）。紅線代表正相關(guān)，藍(lán)線代表負(fù)相關(guān)。
ARGs在水產(chǎn)養(yǎng)殖中可能的影響途徑
有直接證據(jù)表明不同環(huán)境中的ARGs（抗生素耐藥基因）受到抗生素的使用（antibiotic usage）、細(xì)菌（bacteria）、可移動遺傳元件（MGE）及水樣水質(zhì)（water quality）的正向影響；
不同因素對水樣ARGs的影響強(qiáng)度順序為細(xì)菌>MGE>使用抗生素>水質(zhì)；
不同因素對殘留物和肌肉樣品中ARGs的影響順序為細(xì)菌>MGE>使用抗生素；
使用抗生素對不同環(huán)境中ARGs的影響順序為水樣>殘留物>魚肌肉；
PLS-SEM（偏最小二乘結(jié)構(gòu)方程模型）結(jié)果進(jìn)一步證明，在羅非魚養(yǎng)殖過程中，使用枯草三十七肽代替抗生素可以減少ARGs的產(chǎn)生。
圖5 基于偏最小二乘結(jié)構(gòu)方程模型的不同因素對水（a）、殘留物（b）和魚肌肉樣本（c）中目標(biāo)ARGs增殖可能的影響。
使用抗生素會增加耐藥基因和多重耐藥菌數(shù)量，而使用枯草三十七肽處理后多重耐藥菌數(shù)量比使用抗生素處理減少了75%，枯草三十七肽在控制抗生素耐藥基因和多重耐藥菌危害方面具有優(yōu)異的效果。
備注：原文中的天蠶素，主要有效成分為枯草三十七肽。
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